博士(医学)

膵β細胞量の進行性の減少が糖尿病の発症・進展に関与する。糖尿病病態では、インスリン作用不足による高血糖に対する代償的なインスリン産生の増加や脂質異常のためにβ細胞において小胞体ストレスが亢進する。一方、セリン・スレオニンキナーゼGsk-3 はPI3/Akt により抑制され、Gsk-3 の活性制御障害がβ細胞不全と小胞体ストレス関連β細胞死に関連する。しかし、Gsk-3 を介した細胞障害の分子機構は十分に解明されていない。本研究では、Gsk-3 を介する小胞体ストレス応答調節と膵β細胞アポトーシス誘導の関連について検討を行った。方法：マウス単離膵ランゲルハンス氏島(ラ氏島)およびマウス膵β細胞株で薬理学的に小胞体ストレスを誘導した。Ins2 遺伝子に変異を持ち、変異インスリンの蓄積により小胞体ストレスが亢進しβ細胞死を来すAkita mouse 由来の膵β細胞株を遺伝的小胞体ストレスのモデルとして用いた。低分子化合物、あるいは酵素不活性型Gsk-3βの導入によりGsk-3 活性を阻害した。結果：小胞体ストレス下ではGsk-3 を抑制するAkt の活性が減弱しGsk-3 が活性化した。Gsk-3 はATF4 のSer214 リン酸化を介してATF4 とSCF-βTrCP の結合とそれに続くATF4 のユビキチン化、蛋白分解を促進する。したがって、Gsk-3 の抑制によりATF4 の分解速度が低下し、ATF4 蛋白質量が増加することが明らかになった。このとき、β細胞のアポトーシスが減弱することを確認した。この抗アポトーシス効果はdominant negative-ATF4 導入あるいはATF4 ノックダウンにより有意に減弱した。Gsk-3 抑制によるアポトーシス抑制のメカニズムについて、ATF4 の転写標的であるGADD34 および4E-BP1 の発現増強を介した全般的な蛋白翻訳の動態との関連が考えられた。さらに、Akita mouse 由来の膵β細胞株でもGsk-3 活性阻害によるアポトーシス抑制が確認され、これにはATF4 の発現増強と全般的な蛋白翻訳抑制が関連した。以上の結果より、インスリンシグナルとストレス応答のクロストークが明らかになり、Gsk-3/ATF4 経路が糖尿病におけるβ細胞保護の治療標的となる可能性が示唆された。

目的：アルコール使用障害（Alcohol use disorder: AUD）は治療後も再発率が高く再発を予測する患者の要因は確立されていない。AUDでは衝動制御障害、実行機能障害および意思決定障害が報告されているため、本研究ではそれらを用いてAUDの予後予測因子を前方視的に明らかにすることを目的とした。 方法：20歳から70歳までの入院中のAUD患者41名を対象とした。入院中に、①情動顔go/no-go課題（衝動制御課題）および言語流暢性課題（実行機能課題）中の脳血流活性化の指標である酸素化ヘモグロビン積分値を機能的近赤外分光法（functional nearinfrared spectroscopy: fNIRS）を用いて測定し、さらに②不確実な状況下でのリスク選好課題（意思決定）を行った。退院後6ヶ月の再発の有無を主要アウトカムとした。 結果：退院後、24名（58.5％）が断酒を継続し、17名（41.5％）が再飲酒した。断酒群に比べて再飲酒群では、①情動顔go/no go課題における右前頭側頭領域の活性化が有意に低下し、②意思決定課題では有意にリスク追及的であった。断酒群でのみ、右前頭側頭領域の活性と渇望尺度の間に負の相関が観察された。さらに、退院後6ヶ月の飲酒の有無を従属変数とし、年齢、AUD重症度、発症年齢、右前頭葉領域の酸素化ヘモグロビン積分値及び意思決定課題でのリスク選好の５つの独立変数を用いた2項ロジスティック回帰分析を行い、各独立因子の再発への影響を検討した結果、右前頭側頭領域の酸素化ヘモグロビン積分値が小さいほど（オッズ比＝0.161、p＝0.013）、またリスク追及傾向が強いほど（オッズ比＝7.04、p＝0.033）再発リスクが増加することが示された。 結論：右前頭側頭領域の情動刺激に対する脳血流活性化の低下と、リスク追及傾向が、AUDにおける退院6か月後の再発を予測し得る可能性が示された。

方法： 本研究は圧縮センシングを用いた自由呼吸下での多相ダイナミックEOB-MRIを撮像された96人の患者を対象とした。多相ダイナミック撮像として自由呼吸下で11秒毎に1相を5分間、脂肪抑制T1強調画像を撮像し、単純1相と造影28相を撮像した。造影剤投与後20分後に肝細胞相を撮像し、30相目とした。ROI: region of intensityを肝右葉に2つ、左葉に1つを脈管を避けながら可能な限り大きく設定した。3つのROIの信号強度の平均値をそれぞれの時相の信号強度とした。 以下の増強効果のパラメータについて評価した。 CER (contrast enhancement ratio) CERy-x: (SIy -SIx)/SIx (x相目からy相目)とし、 CER4-pre：動脈相 CER7-5：門脈相から動脈相にかけて CER7-pre：門脈相 CER28-pre：5分早期肝細胞相 CER28-7：門脈相から5分早期肝細胞相 CERHBP-pre：20分肝細胞相 GRL (gradient of regression line)：回帰曲線の傾き GRLy-x: x相目からy相目とし、 GRL4-2：動脈相での傾き GRL7-4 ：門脈相での傾き GRL 7-2 ：動脈相、門脈相にかけての傾き GRL 28-7：門脈相から早期肝細胞相での傾き 先行研究によると、肝実質の線維化の重症度(F0-F2 vs F3-F4)に基づいてCERHBP-preでcut off値を0.703として肝細胞相での増強効果がinsufficient HBP enhancement groupとsufficient HBP enhancement groupに分けれるとしている。CERHBP-pre<0.703またはCERHBP-pre>0.703により患者を2群に分け、CERy-x、GRLy-xについて検討した。 上記に加えて年齢、性別、総ビリルビン、プロトロンビン時間、アルブミン、eGFRについても、この2群間で比較した(ウィルコクソンの順位和検定)。 肝細胞相の増強効果に対する影響の大きさを調べるためにノンパラメトリック検定も用いられた(スピアマンの順位相関係数)。 結果： 動脈相(CER4-pre、GRL4-2)に関する結果として、これらはsufficient HBP enhancement groupがinsufficient HBP enhancement groupの間に有意差を認めなかった。 動脈門脈相(1相目～7相目)に関する結果としては、CER7-preはsufficient HBP enhancement groupがinsufficient HBP enhancement groupより有意に高い値となった(0.55 vs 0.44, p<0.001)。CER4-pre、GRL4-2、Gradient7-4、Gradient7-2では2群間に有意差は見られなかった。 5分後の早期肝細胞相(1相目～28相目)に関する結果としては、CER28-pre、CER28-7、GRL28-7においてsufficient HBP enhancement groupがinsufficient HBP enhancement groupより有意に高い値となった(0.64 vs 0.47, 0.10 vs 0.03, 1.27 vs 0.27、すべてp<0.001)。 血液データ(総ビリルビン、プロトロビン時間、アルブミン、eGFR)においても2群間で有意差が認められた(p=0.004-0.049)。CER7-pre、CER28-pre、CER28-7、GRL28-7の各パラメータは血液データのパラメータよりも相関係数が高かった。 CER28-preが最も相関係数が高かった(0.838)。 考察： 動脈相では2群間(sufficient HBP enhancement groupとinsufficient HBP enhancement group)に有意差を認めず、門脈相のパラメータでは有意差が見られた。機序としては推測になってしまうが、肝の線維化の進行に伴い門脈血流は低下しやすいが、動脈血流は比較的保たれることが原因であろうか。 また、肝細胞相の信号強度は、血液データなどによって得られた肝機能を示す数値と相関することはこれまでにも報告されてきた。肝機能が良好であるほど、肝細胞がEOBを取り込みやすいためとされる。 本研究では腎機能と肝細胞相の信号強度とにも相関が見られたが、腎機能が低い症例の方がより肝排泄の割合が増えるからと思われた。 本研究のように、ダイナミック撮像中に得られるパラメータが肝細胞相における肝実質の信号強度と相関することを報告した研究はこれまでになかった。 CER7-pre、CER28-pre、CER28-7、GRL28-7の各パラメータは、いずれも血液データのパラメータよりも相関係数が高かった。 本研究のようにダイナミック撮像中に得られたパラメータを用いれば、血液データよりも高い精度で肝実質の信号強度を予測することができる。 これにより、肝細胞相の撮像タイミングを症例により短縮できることが期待される。 結語： 圧縮センシングを用いた自由呼吸下でのEOB-MRIのダイナミック撮像おいて、肝実質の信号強度の変化を連続データとして捉えることにより得られたパラメータは、肝細胞相での肝実質の信号強度と強い相関を示す。これにより、肝細胞相の撮像タイミングを症例により短縮できることが期待される。

背景：糖尿病患者における聴覚障害の有病率は有意に高く、その予防法の開発が望まれている。 目的：本研究では、糖尿病マウスに対するエイコサペンタエン酸（EPA）投与による早期難聴の予防効果を検討した。 方法：糖尿病モデルとしてTSOD（Tsumura, Suzuki, Obese Diabetes）マウスを、コントロールとしてTSNO（Tsumura, Suzuki, Non Obesity）マウスを使用した。TSNO群とTSOD（EPA-）群（ひまわり油投与）、TSOD（EPA＋）群（EPA投与）の3 群に分けた。聴性脳幹反応（ABR）を測定し、蝸牛を組織学的に評価した。 結果：TSOD（EPA＋）群はTSOD（EPA-）群に比べ、閾値の上昇が小さい傾向を認めた。TSOD（EPA+）群では、生後11 ヶ月から14 ヶ月にかけて、4kHzでのABR 閾値がTSOD（EPA-）群よりも有意に低かった。TSOD（EPA-）群では、血管条の毛細血管内腔の狭小化と蝸牛軸における血管壁の肥厚が観察された。 結論：TSOD マウスに対するEPA 投与による蝸牛血管の動脈硬化の抑制は、加齢に伴う早期難聴を抑制することが示唆された。

角膜の剛性を表す生体力学的指標の一つとして角膜ヒステリシス（CH）があり，CHは眼圧（IOP）や中心角膜厚（CCT）などの影響を受け，眼球全体の剛性も反映することから，CH低下が緑内障の進行リスクとして注目される。一方で，硝子体は眼球を外力から保護する緩衝材としての作用があり，眼球の剛性に影響するが，硝子体とCHとの関連は明らかになっていない。本研究では硝子体切除がCHに与える影響を評価することを目的に，白内障単独手術と白内障手術併施硝子体切除術の術後早期のCHを比較した。白内障手術（PEA+IOL）を施行した18例20眼（PEA+IOL群），黄斑上膜あるいは黄斑円孔に対してPEA+IOL併施の経毛様体扁平部硝子体切除術（PPV）を施行した27例28眼（PPV triple群）を対象とした。術前，術後2週，術後3か月のCH，IOP，CCTおよびCHとCCTの相関関係について後ろ向きに検討した。CHは術前，術後2週，術後3か月で，PEA+IOL群において11.1±1.1mmHg，10.4±1.1 mmHg，11.0±1.0 mmHgであり，PPV triple群において11.0±1.4mmHg，9.8±1.4 mmHg，10.6±1.6 mmHgであった。CHはPEA+IOL群で術前後に有意差は認めなかったが，PPV triple群の術後2週で有意に低下していた。IOPおよびCCTは両群とも術前後に有意な変化は認めなかった。PEA+IOL群の全時点とPPV triple群の術前にはCHとCCTの正の相関関係を認めたが，PPV triple群の術後には相関関係を認めなかった。以上より，PPV triple手術ではIOPやCCT以外による要因で術後にCHが低下することが示され，硝子体切除が眼球の剛性変化をもたらしCH低下に寄与した可能性が考えられた。CHの低下は，外力や眼圧の影響を受けやすい眼球構造であると言えることから，PPV 術後のCH評価は眼圧管理の指標や緑内障の発症，進行リスクを反映する可能性がある。

本研究では、特定の遺伝子型と表現型との関連を明らかにするために、EDAR遺伝子の潜性（劣性）変異に着目し、その特徴を詳細に検討した。具体的には、過去にEDARのDD内に同定された潜性（劣性）遺伝形式を示す4 種類のミスセンス変異（p.R358Q、p.G382S、p.I388T、p.T403M）について、培養細胞での過剰発現系で一連の解析を実施した。これらの変異の中で、p.R358QはEDARADDとの結合能を失い、下流のNF-κB活性を低下させることが知られており、機能喪失の陽性対照として用いた。 まず、細胞溶解液を用いたwestern blot法では、p.R358Qおよびp.T403M変異型EDAR蛋白は野生型EDAR蛋白よりも発現量が減衰し、より大きい分子量を示した。一方で、p.G382Sおよびp.I388T変異型EDAR蛋白は野生型EDAR蛋白と同様の発現パターンを示した。また、各EDAR蛋白の細胞内での局在を解析するために実施した蛍光免疫染色法では、野生型EDAR蛋白と同様にp.G382Sおよびp.I388T変異型EDAR蛋白は細胞質内に局在が認められたが、p.R358Qとp.T403M変異型EDAR蛋白は細胞膜に発現していた。これらの結果から、変異型蛋白間で発現パターンが異なることが示された。続いて行ったNF-κBレポーターアッセイでは、すべての変異型EDAR蛋白がNF-κBの活性化を抑制したが、p.R358Qとp.T403M変異型EDAR蛋白に比べ、p.G382Sとp.I388T変異型EDAR蛋白による抑制効果は軽微であった。EDARとEDARADDの結合を検討した共免疫沈降法では、p.R358Qとp.T403M変異型EDAR蛋白はEDARADDとの結合能を完全に喪失していたが、p.G382Sとp.I388T変異型EDAR蛋白は、ある程度結合能を維持した。これらの解析で、p.G382S変異型EDARの機能喪失の程度は最も軽度と考えられた。 過去の研究で、野生型EDARはTRAF6とは直接結合しないことが報告されており、本研究で実施した野生型EDARとTRAF6間の共免疫沈降法でも同様の結果が得られた。しかしながら、驚くべきことに、本研究で解析した全ての変異型EDAR蛋白はTRAF6と直接結合する性質を示した。 培養細胞での過剰発現系においては、機序は不明だがEDAR蛋白を含む種々のTNF受容体が細胞質内に発現する傾向を示すことが知られていたことから、p.R358Qおよびp.T403M変異型EDAR蛋白の細胞膜への局在は異常な発現パターンと考えられる。NF-κBレポーターアッセイおよび共免疫沈降法の結果から、各変異型EDAR蛋白とEDARADDの親和性はNF-κB活性低下の程度と強く相関することが示唆された。今回解析した4 種類のミスセンス変異は、いずれもEDARの機能や構造に重大な影響を与えると複数のデータベースで推測されていたが、各データベースのスコアは4つの変異の間で非常に類似していた。すなわち、現在の予測ツールの解析能力には限界があり、本研究のように実際に発現・機能解析を行う重要性がハイライトされたといえる。 4種類の変異型EDAR蛋白に共通する唯一の現象は、野生型EDAR蛋白がEDARADDを介して間接的にTRAF6と相互作用するのに対し、TRAF6と直接結合することである。これは、変異型EDAR蛋白がEDAR、DARADD、TRAF6からなる正しい蛋白複合体を形成できないことを示唆しており、EDAR遺伝子変異に起因するHEDの鍵となっている可能性があるが、本現象の病的意義を解明するためには今後のさらなる検討を要する。 本研究で得られた結果に基づき、各変異を機能喪失の度合いで評価した。R358QとT403Mを「重度」、p.I388Tを「中等度」、p.G382Sを「軽度」とした。各変異を報告した文献に提示されていた表現型と比較検討した結果、EDAR遺伝子変異の機能喪失の程度がHEDの重症度と相関している可能性が示唆された。

自動車事故に際しシートベルトに沿って生じる帯状の皮下出血斑はシートベルト兆候（seat belt sign：SBS）と呼ばれている。特に腹部SBS が上前腸骨棘（anterior superior iliac spine：ASIS）よりも上方に位置する場合、腹部臓器損傷の危険性が高い。本研究の目的は、腹部SBS 位置に関連するシートベルト腹部部分（ラップベルト）の位置に影響を与える因子について解析することである。本研究は、健康な成人100名（男性50名、女性50名）の身体所見と、カーシート座位時のラップベルト位置との関係を前向きに検討したものである。身体所見は、年齢、身長、Body Mass Index（BMI）、腹囲を測定した。それぞれ平均年齢37.9歳、平均身長164.9cm、平均BMI 23.9kg/m2、平均腹囲83.4cmであった。X線学的所見は、腰椎前弯（lumbar lordosis：LL）、仙骨傾斜（sacral slope：SS）を測定し、ラップベルト位置は運転席側のラップベルトの中央とASIS相当の位置に鉛テープでマーキングすることで計測した。側面X線撮影を行い、ASISから中央マーカーまでの水平距離（X値）、垂直距離（Z値）を計測した。ラップベルト角度は、2つのマーカーの上端を結ぶ直線と水平線とのなす角度を計測することで求めた。これらの身体所見とX線学的所見との関係を統計学的に解析した。X値とZ値は体重（X値r = 0.73、Z値r = 0.56）、BMI（X値r = 0.77、Z値r = 0.56）、腹囲（X値r = 0.74、Z値r = 0.52）と正の相関があり、ラップベルト角度は体重（r = -0.33）、BMI（r = -0.35）、腹囲（r = -0.37）と負の相関があった。これらの結果からは、BMIの高い乗員ではラップベルトがASISより高い位置にあるため、シートベルト損傷を引き起こす可能性が高い。この解析は、より安全なシートベルトの開発に役立つと思われる。

人工股関節全置換術(Total hip arthroplasty, 以下THA）においてカップ設置角度、カップ設置位置は脱臼の予防、外転筋レバーアームの再建、腸腰筋インピンジメント予防などの点で重要性はますます高くなっている。これまで後方アプローチでのComputed Tomography（CT）-based navigation使用によるcup 設置の正確性に関する報告は多数あるが、仰臥位前方アプローチ（Direct anterior approach、以下DAA）での報告は少なく、また術中イメージを使用した設置精度との比較をした報告はない。今回DAAでのTHAにおけるCT-based navigationを使用したカップ設置精度を検討した。DAAによるTHAを施行した156例171股における、カップ設置精度について、術中mechanical cup alignment guide使用群（MG群63股）、術中fluoroscopy使用群（FS群58股）、CT-based navigation使用群（CTN群50股）の3群について比較した。検討項目は、Lewinneckのsafe zone内のカップ設置割合（％）、カップ外転角(radiographic inclination、以下RI)、カップ前捻角（radiographic anteversion、以下RA）、カップの骨頭中心位置（上下、前後、内外）に関して、術前計画と術後設置角度、位置を比較し、その絶対値誤差をそれぞれ3群にて検討した。術後2週で全例CT検査を実施し、三次元解析ソフトにて誤差を抽出した。Lewinneckのsafe zone内の設置割合は、MG群80.9％（55/63）、FS群81％（47/58）、CTN 群100％（50/50）で、CTN群はMG群（p=0.005）、FS群（p=0.005）よりも有意に高かった。RIはMG群4.4±3.2°、FS群3.6±3.1°、CTN群2.8±2.5°であり、CTN群はMG群（p=0.01）よりも有意に誤差が小さかった。RAはMG群5.8±4.7°、FS群4.8±4.1°、CTN群2.8±1.9°で、CTN群はMG群（p=0.0001）、FS群（p=0.02）より有意に誤差が小さかった。RI、RAに対して絶対値誤差3°以上をoutlierとし各群間で比較した。RI についてMG群63.5％（40/63）、FS群43.1％（25/58）、CTN群36％（18/50）で、CTN群はMG群（p=0.03）より有意にoutlierが少なかった。RAについて、MG群66.7％（42/63）、FS群58.6％（34/58）、CTN群48％（24/50）でCTN群はMG群（p=0.04)よりも有意にoutlierが少なかった。カップの骨頭中心座標（内外:X軸、前後:Y軸、上下:Z軸）については、X軸、Y軸では3群とも有意差は認めなかった。しかしZ軸ではMG群3.3±3.2mm、FS群3.2±3.0mm、CTN群1.8±1.4mmで、CTN群がMG群（p=0.02）、FS群（p=0.007）に対して有意に誤差が少なかった。絶対値誤差より2mm以上をoutlierとし各群間で比較を行った。X軸、Y軸において有意差は認められなかった。一方Z軸に関してはCTN群がMG群（p=0.03)、FS群（p=0.04)よりも有意にoutlierが少なかった。今回の結果から、DAAでのTHAにおいて、CT-basedNavigation使用することでmechanical cup alignment guide使用や、fluoroscopyを使用するよりもカップ設置精度が向上し、有用であることが確認された。

背景：The Union for International Cancer Control（UICC）の tumour、node、metastasis（TNM）分類によって大腸がんの治癒あるいは再発の可能性を予測出来るため、治療方針の決定に役立っている。しかしこの分類法単独による予後の予測は不十分である。そのため予後予測因子として新たなバイオマーカーの同定が望まれている。過去に我々は、根治切除を行ったステージI、II、およびIIIの結腸直腸がん（CRC）患者において免疫組織化学によって同定されたCD4およびforkhead box P3（FOXP3）陽性T細胞密度の組み合わせの無再発生存期間（RFS）・全生存期間に対する有用性を報告した。本研究は、統計的パターン認識の手法である離散ベイズ識別則を応用することにより、T3/T4a ステージIIのCRC患者の再発を予測するマーカーの最適な組み合わせを抽出した。 方法：T3/T4aステージII患者の137症例の切除標本を用いて、12の臨床病理学的および免疫的因子を再発の予後予測因子の候補として解析を行った。 結果：比較的に予後良好とされている T3/T4aステージ II 症例で、CD4・FOXP3陽性T細胞両方の腫瘍浸潤度に最も強い影響があることが示唆された。CD4・FOXP3陽性T細胞両方の腫瘍浸潤度が低い症例群のRFSが明らかに不良であった。 結論：CD4とFOXP3陽性T細胞を組み合わせた腫瘍浸潤度がCRCの予後予測因子となり得ることが示唆され、従来のステージ分類では不十分な患者の層別化も可能になるという新規の知見が明らかになった。補助化学療法は、CD4・FOXP3陽性T細胞両方の腫瘍浸潤度が低い患者に対して考慮されるべきであることが示唆された。

背景・目的：大腸癌（CRC）は、世界的に癌関連死亡の第2位の原因となっており、転移を伴う大腸癌（mCRC）患者の予後不良は緊急の課題である。以前、我々はSOMAscanアッセイを用いて、予後を予測する10種類のバイオマーカー候補を得ることができた。本研究の目的は、得られた候補タンパクの一つであるC-C motif chemokine ligand 7（CCL7）について、mCRC患者における治療前の血清CCL7濃度の予後予測性能を明らかにすることであった。 材料と方法：mCRC患者の血清（n=110）および手術標本（n=85）について、それぞれCCL7のタンパク濃度をELISA法および免疫組織化学法で検討した。また、Cox回帰分析、受信者動作特性曲線(ROC)分析、Kaplan-Meier法を用いて、タンパクの濃度と予後との関係を検討した。結果：血清CCL7濃度が高い患者の全生存期間（OS）は、低い患者と比較し、有意に不良であった。間質中のCCL7発現レベルが高い患者は、低い患者に比べ、有意に予後不良であった。 Carcino embryonic antigen（CEA）および糖鎖抗原19-9（CA19-9）の濃度は、CCL7低値群に比べ、高CCL7群で有意に高値であった。単変量解析および多変量解析により、血清CCL7濃度はmCRCの有意な予後因子であることが明らかになった。また、血清CCL濃度とCEA濃度の組み合わせにおいて、血清CCL7濃度、CEAの両方が高値である患者は、両方が低値である群と比較し、有意に予後不良であった。 結論：治療前の血清CCL7濃度および血清CCL7濃度とCEAとの組み合わせは、mCRCの予後を予測する有用なバイオマーカーである。

背景：肝癌は肝内転移を生じやすく、その予後は不良である。がん幹細胞様細胞（CSLCs）とは、幹細胞性、腫瘍形成能、治療抵抗性に加え、転移能亢進といった特徴を有している。近年では、がんの転移形成や制御において、宿主の免疫機構が重要な働きを担っていると考えられており、今回、肝癌細胞株から誘導したCSLCsの免疫逃避能について検討を行った。 方法：Sphere誘導培地を用いて、Sphere細胞の形態で肝癌細胞株からCSLCsを誘導した。免疫逃避に関わる遺伝子およびタンパク発現を、RNAシーケンス、フローサイトメトリー、ELISA法を用いて解析し、親株とSphere細胞とで比較した。親株とSphere細胞それぞれの、NK細胞に対する感受性について、クロム放出試験を用いて比較検討した。BALB/cヌードマウスを用いた異種移植実験にて、親株とSphereの腫瘍形成能を比較した。 結果：肝癌細胞株SK-HEP-1から誘導したSphere細胞（SK-sphere）では、親株と比較し、細胞膜上のPD-L1、PD-L2、CEACAM1の発現が亢進し、ULBP1、MICA/MICBの発現は低下していた。また、SK-sphereの培地中では、可溶型MICAの濃度が上昇していた。SK-sphereにおけるHLA class I発現低下は見られなかった。肝癌細胞株SK-HEP-1およびHLEから誘導したSphere細胞を用いて、NK細胞に対する感受性をそれぞれの親株と比較したところ、どちらのSphere細胞においてもNK細胞による細胞障害性がより低下していた。NK細胞を保持するヌードマウスにおいて、親株の移植と比較してSK-sphereを移植した際により大きな腫瘍を形成した。 結論：肝癌細胞株から誘導したCSLCsはNK細胞を介した免疫系からの逃避能が亢進している事が示唆された。

背景：UGT1A1*28および*6遺伝子多型は、イリノテカンに関連する毒性の危険因子として知られている。しかし、UGT1A1*28および*6に遺伝子変異を持たない患者においても、イリノテカンによる重篤な副作用が認められている。我々は、UGT1A以外のイリノテカン毒性の有用なバイオマーカーを同定するために、全エクソームにおける遺伝子多型を調査した。 方法：FOLFIRI療法、FOLFOX療法、FOLFOXIRI療法を投与された転移性大腸癌（mCRC）患者178例とmodified FOLFIRINOX療法、ゲムシタビン＋ナブパクリタキセル療法を投与された膵臓癌患者87例を対象とした。ゲノムワイドスクリーニングは全エクソームシーケンス（WES）を用いて行い、バリデーション解析は加水分解プローブを用いたqPCRを用いて実施した。 結果：FOLFIRI療法症例のWES（n = 15）により、7つの一塩基多型（SNP）がイリノテカン関連毒性である好中球減少のバイオマーカー候補として同定された。7つのSNPのうち、R3H domain and coiled-coil containing 1（R3HCC1; c.919G>A, rs2272761）のSNPは、検証サンプル症例のグレード3以上の好中球減少と有意な関連性を示した。mCRC患者に対するFOLFOXIRI療法（n = 23）または膵臓癌に対するmodified FOLFIRINOX療法（n = 40）といったイリノテカン含有の3剤併用化学療法患者でも、R3HCC1多型と好中球減少との間に有意な線形傾向がみられた（それぞれP = 0.017 および0.046 ）。一方で、イリノテカンを含まないレジメン（mCRC患者に対するFOLFOX療法（n = 66）、膵臓癌に対するゲムシタビン＋ナブパクリタキセル療法（n = 47））患者では、有意な関連は認められなかった。 結論：R3HCC1多型は、mCRCと膵臓癌に対するイリノテカンを含む化学療法の毒性に関する有用なバイオマーカーとなる可能性がある。

細胞シート移植治療の普及には利便性の高い細胞シートの保存方法の開発が不可欠である。細胞シートから分泌される成長因子によって創傷治癒は促進されると考えられてきたため、その保存には細胞生存率が重要視されてきた。そのため、積層線維芽細胞シートの乾燥保存に関する検討はこれまでにない。本研究では、乾燥保存した積層線維芽細胞シート（Dryシート）を開発し、糖尿病マウス全層皮膚欠損モデルでの創傷治癒促進効果を検証した。 マウスの尾から単離した線維芽細胞を用いて、積層線維芽細胞シート（Livingシート）を作製した。Livingシートを風乾させ、Dryシートとした。Livingシートに凍結解凍操作を繰り返してFreeze-thaw（FT）シートとした。各シートを培地に浸漬して溶出液とし、各溶出液中の成長因子を測定した。Vascular endothelial growth factor（VEGF）とhepatocyte growth factor（HGF）はDryシートとLivingシートで検出したのに対し、fibroblast growth factor-2（FGF-2）とhigh mobility group box 1（HMGB1）はDryシートのみで検出した。FTシートではこれらの成長因子をほとんど検出しなかった。細胞シートの溶出液を添加して線維芽細胞を培養し、溶出液の生理活性を線維芽細胞増殖試験で検討した。DryシートはLivingシートと比べ、細胞増殖と成長因子産生量を有意に促進し、FGF-2中和抗体で阻害すると、この細胞増殖反応は抑制された。糖尿病マウス全層皮膚欠損モデル（C57BL/6N）において、自家及び他家（C3H/He）の線維芽細胞から作製したDryシート貼付群は無治療群に比べ、創の閉鎖を有意に促進した。Dryシートは常温（23℃）よりも冷蔵（4℃）での保存安定性に優れ、少なくとも4週間の冷蔵保存ではDryシートのFGF-2の減少を認めなかった。 以上から、DryシートはFGF-2の放出という新たな作用機序で創傷治癒を促進することが明らかになった。他家細胞から作製されたDryシートは、創傷治癒を促す再生医療において新たな扱いやすい被覆材であることが示唆された。

本研究の目的は、皮膚潰瘍モデルマウスにおいて、凍結保存した他家線維芽細胞シートの治療効果を検討することである。他家細胞シートの凍結保存が可能であれば、様々な疾患への応用が可能であり、大幅なコストダウンによる再生医療の普及に貢献できると考えられる。本研究では、3Dフリーザーを用いて線維芽細胞シートの凍結を行った。凍結融解した線維芽細胞シートは、非凍結線維芽細胞シートと比較して、細胞生存率は約80であり、vascularendothelial growth factor VEGF ）、hepatocyte growth factor HGF）、stromalderived factor 1α SDF1αの培養上清中の濃度が50％以上で、transforminggrowth factor β1 TGFβ1の分泌能は同等であった。皮膚潰瘍モデルマウスにおいて、非凍結線維芽細胞シート群と凍結融解した線維芽細胞シート群の間で、自家細胞、他家細胞のどちらも創傷治癒率に差はなかった。また、血管新生の程度も同等であった。治癒組織におけるCD3陽性細胞数は、自家線維芽細胞シート群と比較して他家線維芽細胞シート群で多く見られた。しかし、病理組織学的には、凍結融解した他家線維芽細胞シート群の線維化、新生血管密度、創傷治癒速度は、非凍結他家線維芽細胞シート群に比べて凍結融解した自家線維芽細胞シート群に類似していた。これらの結果から、凍結融解した他家線維芽細胞シートが難治性皮膚潰瘍に対する有望な治療オプションとなる可能性が示唆された。

ミエリン関連糖蛋白 (myelin-associated glycoprotein: MAG) は，神経組織の髄鞘に局在する膜貫通糖蛋白であり，MAGに対するIgM型自己抗体 (MAG抗体) を有する患者では脱髄性末梢神経障害をきたす．末梢神経には血液神経関門 (blood-nerve barrier: BNB) があるために，通常は免疫グロブリンなどの大きな分子が神経内に侵入することはできない．しかし，MAGニューロパチー患者から採取した腓腹神経内有髄神経線維の髄鞘にはMAG抗体が沈着しており，MAG抗体はBNBを通過していることが想定される．MAG抗体のBNB通過機序を明らかにすることを目的に，MAGニューロパチー患者血清，ヒトBNB構成内皮細胞株と周皮細胞株，MAGニューロパチー患者から採取した腓腹神経検体を用いて解析を行った．MAGニューロパチー患者血清を作用させた内皮細胞に対して，全RNAトランスクリプトーム解析と免疫染色を用いたハイコンテントイメージング解析を行い，NF-κBの活性化とTNF-αの発現増加を確認した．次に内皮細胞と周皮細胞を共培養したBNB in vitroモデルで透過性を解析した． MAGニューロパチー患者血清を作用させた結果，10 kDaデキストランやIgGの透過性を変化させることなく，IgMやMAG抗体の透過性を亢進させ，TNF-αの中和抗体を添加することでIgMやMAG抗体の透過性は抑制された．電子顕微鏡による観察ではMAGニューロパチー患者の腓腹神経内でBNBを構成する微小血管の密着結合は保たれており，内皮細胞内に多数の小胞が確認された．MAGニューロパチー患者では，MAG抗体はBNB構成内皮細胞の自己分泌TNF-αの増加を介して内皮細胞質内をトランスサイトーシスの機序により通過していることが示唆された．TNF-α阻害薬は既存の薬剤であり，本研究結果から，TNF-α阻害薬によるMAGニューロパチー患者への新たな治療戦略が期待される．

小胞体ストレスの増加は、動脈硬化において血管平滑筋培養細胞（VSMCs）の形質転換（分化→脱分化）と強く関連している。小胞体のCa2+貯蔵量減少は、VSMCs における小胞体ストレスの増加の主要な原因の一つである。リアノジン受容体（RyR）は筋小胞体膜上に存在する主要なCa2+放出チャネルである。正常細胞の安静状態ではカルモジュリン（CaM）はRyR と結合し、RyR を閉鎖した状態で安定化させている。CaM とRyR の結合が減弱すると、RyR から異常なCa2+漏出が起こり、Ca2+貯蔵量が減少し、小胞体ストレスが増加する原因となり得る。そこで我々は、マウスのVSMCs を用いてRyR に結合しているCa（CaM-RyR）が小胞体ストレスにより引き起こされるVSMCs の形質転換に重要な役割を果たしているか否か、また、CaM-RyR の結合親和性を高める作用を有するダントロレン（DAN）がVSMCs の形質転換に影響を与えるか否かを評価した。 小胞体ストレスによりCaM がRyR から解離し、核内へ移行することにより、MEF2 とKLF5 の核内での発現量が増加し、このMEF2-KLF5 のシグナル伝達経路が活性化することでVSMCs が形質転換(分化→脱分化)し、増殖能や遊走能を有するようになり動脈硬化巣の形成や不安定化につながるという新たな知見を得ることができた。さらにCaM-RyR の結合親和性を高めるDAN は、RyR チャネルを安定化させ、異常なCa2+漏出を抑制し、小胞体内のCa2+貯蔵量を保持することで小胞体ストレスの増加を抑制し、さらにCaM の核内への移行を制御することで、MEF2-KLF5 経路の活性化を抑制し、その結果としてVSMCs の形質転換を抑制することが示され、動脈硬化巣の進展化、不安定化に対する全く新しい治療戦略となり得る可能性があることが示唆された。

Pandemic influenza virus A(H1N1)pdm09 infection occurred in healthy children and young adults, but asthmatic patients presented more rapid progression of respiratory distress and plastic bronchitis. To investigate the pathogenesis of worsening respiratory symptoms after A(H1N1)pdm09 infection, we focused on matrix metalloproteinase‐9 (MMP‐9) and tissue inhibitor of metalloproteinases‐1 (TIMP‐1). MMP‐9 and TIMP‐1 levels in bronchoalveolar lavage fluid and serum from mice with and without asthma were evaluated after A(H1N1)pdm09 or seasonal A(H1N1) infection. MMP‐9 levels were more elevated in Asthma/A(H1N1)pdm09‐infected mice than in non‐Asthma/A(H1N1)pdm09‐infected mice on both 3 and 7 days post‐infection. Immunohistochemical findings in this pneumonia model showed that MMP‐9 and TIMP‐1 positive cells were observed in blood vessels and bronchus of lung tissue in severe pathological findings of pneumonia with asthma. Microscopically, shedding cells and secretions were conspicuous in the trachea on days 3 and 7 postinfection, in the A(H1N1)pdm09‐infected mice with asthma. Our results suggest that MMP‐9 and TIMP‐1 expressions are related to severe pneumonia in the A(H1N1)pdm09 infection with asthma, leading to cause epithelial cell shedding.

背景：がん幹細胞 (CSC) は、発がん、再発、転移、治療抵抗性に重要な役割を果たすと考えられている。我々は、化学療法抵抗性と転移能を有するがん幹細胞様スフィア細胞 (CSLC) の誘導に成功した。CSLC に対する標的治療の開発を可能にするため、CSLC のこの表現型の原因となる遺伝子を同定した。 方法：ヒト肝がん細胞株SK-HEP-1 を用い、独自のスフィア誘導培地を用いてCSLCを誘導し、HuH-7 細胞を非スフィア形成細胞として同条件で使用した。RNA シーケンシングを行った後、定量的 RT-PCR とウェスタンブロッティングで検証した。ノックダウン (KD) 実験はCRISPR-Cas9 によるゲノム編集により行い、レスキュー実験は発現プラスミドベクターを用いて行った。細胞の化学療法抵抗性と肝転移は、MTS アッセイと細胞の重度免疫不全マウスへの脾臓注入後の解析で評価した。培地中のエクソソームの定量は、EL ISA 法を用いて行った。 結果： RAB3B は、RNA シーケンシングによりCSLC と予後不良の肝細胞がん (HCC)の両方で発現が増加している遺伝子として同定された。RAB3B-KD 細胞は、スフィア形成、化学療法抵抗性、転移能などのCSLC 表現型の変化を示し、これらはRAB3Bの相補化によって回復された。CSLC ではエクソソーム分泌の増加が観察されたが、RAB3B-KD 細胞では観察されなかった。また、RAB3B の発現は、ABCG2、APOE、LEPR、LXN、TSPAN13 の発現と相関していた。 結論：RAB3B のアップレギュレーションは、CSLC の化学療法抵抗性と転移能に重要な役割を担っている可能性がある。

転写因子CCAAT/enhancer-bringing protein beta（C/EBPβ）は、IGF-binding protein-1（IGFBP-1）やprolactin（ERL）遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域において、転写活性マーカーであるHistone-H3 lysine-27 アセチル化(H3K27ac)を誘導するパイオニア因子であり、ヒト子宮内膜間質細胞（ESC）の脱落膜化に貢献することを我々はこれまでに報告している。パイオニア因子の一部はヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性を有するコファクターと複合体を形成することで機能する。我々は、C/EBPβと共役するHATタンパクとしてp300を同定しているが、それ以外のコファクターについては不明である。Peroxisome proliferator-activated receptor gamma comma coactivator 1-α（PGC-1α）はH3K27acを制御することが知られている転写共役因子である。PGC-1αはESCでも発現しているが、脱落膜化におけるPGC-1αの機能は不明である。そこで、PGC-1αがC/EBPβの転写共役因子として働き、脱落膜化過程においてH3K27ac誘導に関与しているのではないかと考え検討した。脱落膜化を誘導するためにESCをcAMP存在上で培養した。cAMPによるIGFBP-1およびPRLの発現上昇はPGC-1αのノックダウンにより抑制された。また、cAMPはIGFBP-1およびPRLのプロモーターとエンハンサー領域に存在するC/EBPβ結合部位へのPGC-1αとp300のリクルートを増加させた。さらに、PGC-1αをノックダウンするとC/EBPβとp300に結合、およびH3K27acレベルが低下したことから、PGC-1αはこれらの領域でC/EBPβおよびp300とヒストン修飾複合体を形成することでH3K27ac誘導に関与していることが示された。さらにPGC-1αの発現制御機構を調べるために、C/EBPβを上流因子として着目した。PGC-1αのエンハンサー領域へのC/EBPβの結合はcAMPで増加した。また、これらのエンハンサーをゲノム編集により欠失させた細胞ではPGC-1αの発現が減少したことから、C/EBPβは我々が見出したエンハンサー領域に結合することでPGC-1αの発現を上昇させると考えられた。以上より、PGC-1αはC/EBPβの新規エンハンサーへの結合によって発現誘導されること、また、C/EBPβとp300と共にヒストン修飾複合体を形成して、IGFBP-1およびPRLのプロモーターとエンハンサーにエピゲノム変化を引き起こすことで脱落膜化に貢献していることがわかった。

【目的】代謝状態の朝晩の変化を理解することは、代謝障害を管理するためには重要である。我々は、インスリン分泌とインスリン感受性の観点からこの朝晩の変化を解析し、さらに概日リズムとの関連性を含めて検討することを目的とした。 【方法】非糖尿病成人男性14人と10人に対し、それぞれ75ｇ経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)と高インスリン正常血糖（HE）クランプ実験を行った。各被験者に対し、午前8時と午後8時にOGTTまたはHEクランプを1回ずつ行った。ただし試験時間の順序は無作為とした。各試験直前に毛根を採取し、毛包における時計遺伝子発現量をリアルタイムPCR法で解析した。また、マウスの肝臓と筋肉でもAKTリン酸化をウエスタンブロット法により解析した。 【結果】OGTTの結果から、耐糖能は午前8時の方が良好であることがわかった。これは、OGTTにおける負荷後60分までのインスリン早期分泌とHEクランプで説明される骨格筋インスリン感受性の違いに起因すると考えられた。一方、OGTTにおける肝臓のインスリン抵抗性指数によって推定される肝インスリン感受性は、午後8時の方が良好であった。60分までのインスリン分泌量と肝臓のインスリン抵抗性指数の朝晩の差は、Per2のｍRNAの相対的発現量と有意に相関していた。ΔGIR（20時の値－8時の値）は、Δ非エステル化脂肪酸（NEFA）と有意に相関したが、時計遺伝子発現との相関は認められなかった。ΔNEFAは、E4bp4のmRNA発現量およびΔコルチゾールと有意に相関していた。マウスでは、ヒトの研究から予想されるように、AKTリン酸化は活動時間の初めに肝臓で減少し、筋肉で増加していた。 【結語】各組織の糖代謝は朝と晩で大きく異なっており、脂質代謝、時計遺伝子およびコルチゾールの影響を受けていることがわかった。この関連性についてのより深い知見が代謝障害の新たな改善法の開発に寄与する可能性がある。

右心室 (RV) の機能障害とそれに関連する不整脈は、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) の予後の重要な決定要因として認識されている。今回心臓リアノジン受容体 (RyR2) の安定剤であるダントロレン (DAN) による右室心筋への直接的な薬理学的介入が、モノクロタリン (MCT) 誘発性PAHラットモデルにおいてRV機能障害および不整脈に対する保護効果を有するかどうかを調査することを目的とした。方法として雄の8週齢のSprague-Dawleyラットに、PAHの誘発のためにMCTを腹腔内投与した。カテコールアミンによる心室頻拍 (VT) の誘発も、単離された心筋細胞におけるRyR2を介したCa^{2+}放出特性に関連して評価された。RVの形態と機能に対する慢性的な圧力過負荷の独立した影響を評価するためには、肺動脈縮窄モデルも確立した。結果、MCT誘発PHAラットモデルでは、RV肥大、拡張、および機能低下が観察され、MCT誘発2か月後の生存率は0%であった。対照的に、慢性DAN治療はこれらすべてのRVパラメータを改善し、生存率を80%に増加させた。慢性的なDAN療法はまた、RyR2からのカルモジュリンの解離を防ぎ、それによってMCTによって誘発された肥大したRV心筋細胞におけるCa^{2+}スパークと自発的なCa^{2+}トランジェストを抑制した。エピネフリンは、MCT誘発性PAHのラットの50%以上でVTを誘発したが、慢性DAN治療によってVTの完全に抑制した。以上よりDANによるRyR2の安定化は、PAHに関連するRV機能障害および致命的な不整脈の発症に対する新しい治療薬としての可能性を秘めている。

We previously discovered that SPC/Fyn/Rho-kinase (ROK) pathway mediates the Ca^{2+}-sensitization of coronary arterial smooth muscle (CASM) contraction leading to vasospasm, a major cause of sudden death. Lately, we have been trying to find and develop more natural edible compounds which can treat and/or prevent the SPC-induced abnormal CASM contraction, and finally the first to discover that tangeretin (5,6,7,8,4'-prentamethoxyflavone), a natural compound extracted from citrus plants, can inhibit the SPC-induced CASM contraction both in the pretreatment and posttreatment. In porcine CASM tissues, tangeretin showed remarkable inhibitory effects on the SPC-induced contraction with modest inhibitory effects on the high K^+-depolarization-induced Ca^{2+}-dependent contraction, both in pretreatment and posttreatment at the optimal concentrations; Regarding the mechanisms, tangeretin markedly abolished the SPC-induced cell contraction through inhibiting the SPC-induced activation and translocation of Fyn and ROK from the cytoplasm to the cell membrane in cultured CASM cells, resulting in the reduction of phosphorylation of myosin light chain. Taken together, these findings indicate that tangeretin, upon pre- or post- treatment, inhibits the SPC-induced CASM contraction through suppressing the Fyn/ROK signaling pathway, thereby suggesting that tangeretin can be a potential candidate for the treatment and/or prevention of vasospasm.

Huntingtin-associated protein 1 (HAP1) is a neural huntingtin interactor and being considered as a core molecule of stigmoid body (STB). Brain or spinal cord regions with abundant STB/HAP1 expression are usually spared from neurodegeneration, whereas the regions with little STB/HAP1 expression are always neurodegenerative targets. The enteric nervous system (ENS) can act as a potential portal for pathogenesis of neurodegenerative disorders. To date, the expression of HAP1 and its neurochemical characterization have never been examined there. In the current study, we determined the expression and immunohistochemical phenotypes of HAP1 in ENS of adult rodents using Western blotting and light/fluorescence microscopy. HAP1 immunoreactivity was strongly expressed in both myenteric and submucosal plexuses of ENS. STBs were observed in the cytoplasm of most of the HAP1-immunoractive (ir) cells in ENS. In myenteric plexus, a large number of calretinin, calbindin, NOS, VIP, ChAT, SP, somatostatin, and TH-ir neurons showed HAP1 immunoreactivity. In contrast, most of the CGRP-ir neurons were devoid of HAP1-immunoreactivity. In submucosal plexus, almost all the cholinergic secretomotor neurons containing ChAT/ CGRP/ somatostatin/ calretinin, non-cholinergic secretomotor neurons containing VIP/TH/calretinin and vasodilator neurons containing VIP/calretinin express HAP1. Our current study is the first to clarify that HAP1 is highly expressed in excitatory motor neurons, inhibitory motor neurons, and interneurons but almost absent in sensory neurons in myenteric plexus. While, HAP1 is expressed in all neuronal subgroups of Meissner’s plexuses. These suggest that due to lack of putative STB/HAP1 protectivity, the sensory neurons (Dogiel type II) might be more vulnerable to neurodegeneration than STB/HAP1-expressing Dogiel type I neurons in myenteric plexus and secretomotor/vasodilator in Meissner’s plexuses. Our current results may reflect the involvement of HAP1 in modulation of excitatory and inhibitory motor neuron functions in myenteric plexus and the secretomotor and vasodilator functions of submucosal neurons. It will be of great interest to elucidate the physiological or pathological roles of HAP1 in ENS. Our current results might lay a basic foundation for future studies that seek to clarify the physiological/pathological effects of STB/HAP1 in the ENS.

背景：経食道心エコー図検査（TEE）は、心房細動（AF）に対する肺静脈隔離術（PVI）前の左心房（LA）および左心耳（LAA）における血栓の有無の評価を行うゴールドスタンダードな検査である。TEEは比較的安全とされているが、近年PVIに先行するTEEが食道粘膜損傷（EMI）を引き起こす可能性があることが報告された。 目的：PVIを施行したAF患者におけるTEE関連EMIの発生率とその危険因子を検討すること。 方法と結果：3D TEEプローブを用いた術前TEEと術後上部消化管内視鏡検査を受けたPVI患者262人を対象とした。TEE関連EMIは16人（6.1%）の患者（18病変）、PVI関連EMIは5人（1.9%）の患者（8病変）で認められた。TEE関連EMIは上部食道の右側と中部食道の左前側で多く認められた。1人の患者で軽度の胸部違和感を認めた。多変量解析では、高齢はTEE関連EMIの独立した危険因子であった（オッズ比1.08、95%信頼区間1.01-1.16；P=0.0274）。 結語：3D TEEプローブによるTEE関連EMIは、PVI施行患者の6.1%で認められ、高齢であることはTEE関連EMIの危険因子であった。これらの所見から、特に高齢患者においては、LA・LAAにおける血栓評価として他の画像診断を考慮する必要があるかもしれない。

近年、遺伝子改変T細胞を用いた養子免疫療法の臨床応用が進められているが、未だ治療成績は満足のいくものではなく、更なる治療の進歩が求められている。我々はこれまで、自律性にIL7とCCL19を発現するCAR-T細胞（7×19 CAT-R細胞）が優れた抗腫瘍活性を発揮することを示した。本研究ではIL7及びCCL19がTCR-T細胞の抗腫瘍活性を増強させる可能性を検証するため、腫瘍抗原であるP1Aを特異的に認識するTCR-T細胞（P1A-T細胞）にIL7及びCCL19を分泌させる遺伝子改変を加えた7×19 P1A-T細胞を作製した。P1Aを有する細胞株であるP815を皮下接種したマウスに対する養子免疫療法において、7×19 P1A細胞はIL7及びCCL19を分泌しないP1A-T細胞（Conv. P1A-T細胞）と比較し優れた抗腫瘍効果を示した。腫瘍拒絶マウスにおいては、Conv. P1A-T細胞を使用したマウスと比較し優れた免疫記憶が形成されていた。また抗PD-1抗体を用いた複合免疫療法を行うことで、7×19 P1A-T細胞の有する抗腫瘍効果は更に増強された。CRISPR/ Cas9システムを用いPdcd1をknockdownした7×19 P1A-T細胞は対照7×19 P1A-T細胞と比較し強い抗腫瘍効果を示したが、抗PD-1抗体を併用することで更なる抗腫瘍効果の増強を認めたことから、7×19 P1A-T細胞の発揮する抗腫瘍効果には7×19 P1A-T細胞そのものばかりでなくマウス内在性のT細胞が関与していることが分かった。また、7×19 P1A-T細胞においても抗PD-1抗体との併用により抗腫瘍効果が増強することを確認した。本研究における検証により、7×19 TCR-T細胞及び7×19 CAR-T細胞を用いた免疫療法が抗悪性腫瘍療法の発展に寄与できる可能性が示された。

オメガ3長鎖多価不飽和脂肪酸(ω-3)は海産魚や魚油に含まれる必須脂肪酸で、抗炎症効果を有することから非感染性ぶどう膜炎の有効な治療になる可能性がある。多くのぶどう膜炎でみられる獲得免疫による炎症反応は、樹状細胞（DC）、マクロファージ、およびBリンパ球を含む抗原提示細胞(APC)による抗原提示から開始され、炎症のトリガーとして重要である。これまでに我々はω-3長鎖多価不飽和脂肪酸（LCPUFA）が、実験的自己免疫性ぶどう膜炎モデル（EAU）の眼炎症を抑制することを示した。今回、ω-3によるEAUの抗炎症効果に対する APCの関与を検討し、その作用機構について解析した。 C57BL/6マウスに等カロリーに調整したω-3もしくはω-6を含有した餌で給餌し、安楽死後に回収した脾臓細胞をマイトマイシンC処理してAPCを調整した。これらをEAU誘導したマウスから単離したCD4陽性T細胞と共培養し、種々の炎症性サイトカインの発現量および3H-チミジン取り込み量を指標とした増殖能を評価した。次にω-3群のAPCをDC、マクロファージ、B細胞を含む残りの細胞群（B細胞他）に分離し、ω-3の炎症作用を担当する細胞を探索した。続いて、ω-3で賦活化したDCによる抗炎症効果を検討するため、ω-3群のDCを単離し、EAUを誘導したマウスにAdoptive transfer(養子細胞移植)し、臨床および組織学的スコアを評価した。最後にω-3がDCに直接作用して抗炎症効果を発揮するか否かを検討した。 C57BL/6由来DCとBALB/c由来CD4陽性T細胞を混合培養して混合リンパ球反応MLR(mixed lymphocyte reaction)を誘導した培養系に、代表的なω-3脂肪酸であるDHAおよびEPAを投与し、T細胞増殖能を評価した。 ω-3群のAPCは、ω-6群に比較してIFN-γ、IL-17の発現量およびT細胞増殖能を有意に低下した。その抗炎症効果はAPCから単離したマクロファージやB細胞他ではみられず、DCのみで保存された。さらに、ω-3群のDCをAdoptive transferしたEAUマウスでは、炎症スコアが有意に低下した。DHA・EPAで賦活化したDCはMLRによるT細胞増殖能を有意に抑制した。 以上より、ω-3の経口摂取によるEAUの眼炎症抑制効果は、APC、特にDCを介在して発揮されることが示された。

ラット坐骨神経結紮モデル（SNL）は最も一般的に神経障害性疼痛の実験に用いられるモデルラットであり、運動麻痺を生じないことでも知られている。神経障害性疼痛モデルの疼痛評価にはこれまでフォンフレイテスト（機械的アロディニア評価）と熱刺激回避テストが用いられてきた。しかしこれらのテストは臨床で用いられる神経学的検査とは全く異なる手法での評価である。神経障害性疼痛を有する患者では、両下肢の協調運動が乱れ，歩行時の下肢の動きに左右差を生じていることが多い。本研究において、私達はヒトと同様な疼痛行動や疼痛に伴う歩行障害などが実際には生じているのではないかと考え、三次元歩行解析を行いて本モデルの関節の動きや歩行時の動態解析を行った。今回の解析にはキネマトレーサーシステムを用いた。 機械的アロディニアに関するSNLの効果として術後１週間から８週間にわたり、回避行動閾値の47±6.1％の低下を認めた。ＳNLラットにおける股関節・膝関節・足関節のマーカーの矢状面の軌跡は歩行中に大きな変動を認めた。歩行中の不安定性を示す患側左股関節・膝関節の上下端の高低差は、SNLラットでほうが有意に大きかった。歩行パターンを示す、両足同時接地時間はSNLラットのほうが有意に長い結果であった。左右下肢の協調運動を評価するため、両下肢の歩行周期時間も計測した。歩行周期の左右差を示す左右比は、コントロール群のラットでは1.0±0.08と左右差がほぼないのに比較し、SNLラットでは0.62±0.15と有意に左右下肢の歩行周期が異なることが示唆された。 フォンフレイテストや熱刺激回避テストは臨床現場で使用されることのない疼痛機能評価であるが、こうした新しい三次元歩行動態解析技術を用いることができれば、神経障害性疼痛患者における疼痛行動も、定量的かつ数値化して示すことが可能になる可能性について示すことができた。従来の神経障害性疼痛モデルにおける、疼痛機能評価に関する臨床と実験モデルの大きなかけ離れについての問題点を解決し、将来的にはヒトでの機能評価にも応用できる新しい三次元歩行動態解析技術について報告し、実際のラット坐骨神経結紮モデルでのデータを示した。

新規ヒトin vitroおよびex vivo BBBモデル，in vivo モデルを用いて，NMOSDの病態生理とサトラリズマブの作用機序を，BBB破綻の点から検討した．血管内皮細胞に対するペリサイトおよびアストロサイトの足突起の接触を再現した3層共培養系を構築し，これを用いて静的in vitroモデルおよび流速負荷型ex vivoモデルを作製した．これらのBBBモデルを使用し，バリア機能の持続測定，白血球のmigration，NMO-IgGとサトラリズマブのBBB透過性を評価した．In vivo研究では，脊髄中でIL-6が著増するEAEマウスのin vivoでのBBB破綻に対して，マウスIL-6受容体抗体MR16-1が与える効果を評価した．In vitroおよびex vivoでの実験では，NMO-IgGがサトラリズマブおよびNMO-IgGの脳内透過性を亢進させること，サトラリズマブがNMO-IgGが誘導するT細胞のmigrationとBBB破綻を抑制することが示された．In vivo研究では，IL-6シグナル伝達の阻害によって，T細胞の脊髄への浸潤が抑制され，脊髄炎の発症が抑えられた．これらの結果から以下のことが示された．（1）我々が作製した，3層共培養によるin vitroおよびex vivo BBBモデルは，バリア機能，白血球のmigration，脳内移行性を評価するために理想的なBBBモデルである．（2）NMO-IgGは，バリア機能の減弱によってNMO-IgG自身の透過性を亢進し，アストロサイトからのIL-6分泌を誘導し，さらなるバリア機能の障害と細胞浸潤の制御破綻を引き起こす．（3）サトラリズマブは，NMO-IgGの共存下でBBB通過が容易となり，BBB機能障害と炎症細胞浸潤を抑制する結果，NMOSDの発症を予防する．

本研究の目的は、健常人において、血漿中の尿酸値（UA）と分枝鎖アミノ酸および芳香族アミノ酸（BCAAおよびAAA）の濃度の関連を明らかにすることである。 合計2,804人の健常人について、血漿UAレベルに応じて3つのグループに分類した。その3グループ間における、BCAAとAAAの濃度の関連を、分散分析（ANOVA）と共分散分析（ANCOVA）により解析した。 この研究で対象としたすべてのBCAAとAAAの濃度は、トリプトファンを除き、全てがUA濃度の各レベルに応じて、漸進的に有意に増加した（P<0.001）。また、全体として、個々のBCAAおよびAAAについて、最低のカテゴリーの差にくらべ、高いカテゴリーの差の方が、より大きかった。本研究は、血漿中のBCAAおよびAAAと、UAのレベルについて、潜在的に、密接な関係が存在していることを示唆した。今後、それらの間の因果関係および相互作用を解明する研究が必要である。

抗がん剤の副作用である口腔粘膜炎の改善にはエレンタール^(R)は有効であることが報告されている。5-フルオロウラシル (5-FU) の副作用には口腔粘膜炎がある。そこでエレンタール^(R)の中で口腔粘膜炎の改善に最も有用な成分の特定を試みた。マウス（対照群を除く）に5-FUを4日間腹腔内注射し、生理食塩水（対照群、5-FU群）、デキストリン（デキストリン群）、アミノ酸（17AA群）、エレンタール^(R)（エレンタール^(R)群）のいずれかを7日間投与した。

（目的）排卵期の黄体形成ホルモン（LH）サージは、顆粒膜細胞（GCs）において、遺伝子発現や細胞機能の急激な変化を引き起こし、黄体化を誘導する。本研究では、黄体化過程のGCsにおける遺伝子発現の経時的変化と、エピジェネティックな遺伝子発現制御機構に着目し、ゲノムワイドに黄体化過程の遺伝子発現と細胞機能変化を明らかにすること、および遺伝子発現制御や細胞機能変化とヒストン修飾H3K4me3変化の関連性を明らかにすることを目的とした。 （方法）幼若雌マウスにeCG-hCG注射による過排卵刺激を行い、hCG投与前、投与後4時間、12時間の時点でGCsを回収し、RNAシークエンスとH3K4me3抗体を用いたChIPシークエンスを行った。 （結果）RNAシークエンスにより、多数の発現変動遺伝子が同定され、遺伝子発現の時間的変化に応じて8つのパターンに分類された。多くの遺伝子は、hCG刺激後4時間で一過性に発現上昇または低下していた。これらの遺伝子群に関連する細胞機能をGene Ontology解析で調べたところ、ステロイド産生、排卵、卵丘細胞複合体の膨化、血管新生、免疫、活性酸素代謝、炎症反応、脂質代謝、オートファジーが同定された。さらに、DNA修復と細胞サイズの増大という2つの機能がこれまでに報告されていない細胞機能として同定された。ChIPシークエンスにより、黄体化過程ではゲノム全域にわたってH3K4me3が急激に変化し、遺伝子発現に関与することが示唆された。mRNA発現データとH3K4me3のデータを統合解析したところ、H3K4me3はステロイド産生、排卵、COCの拡大、血管新生、炎症反応、免疫、活性酸素代謝、脂質・糖代謝、オートファジー、細胞サイズの調節などに関与することが示唆された。 （結論）LHサージ後の黄体化過程にあるGCsにおいて、遺伝子発現はゲノムワイドに変化し、細胞機能が劇的に変化する。H3K4me3の変化は、これらの急激な遺伝子発現制御に関与し、種々の細胞機能を調節することでGCsの黄体化に寄与する可能性が示された。

方法： 2010年10月から2019年9月までに山口大学医学部附属病院および川崎医科大学附属病院で画像検査を受けられた患者を後ろ向きに検討した。炭酸ガス拡張を用いたCTC直後にDCE-CTを実施した82例をCE-CTC群とした。CE-CTC群と同様のDCE-CTプロトコールで撮像されたCTC非併用のDCE-CTの症例のうち、年齢や性別をマッチさせた77例を対照群とした。CE-CTC群は男性48名、女性34名で年齢は21～85歳（平均60歳）、対照群は男性46名、女性31名で年齢は20～84歳（平均60歳）であった。 CTは多列検出器CT装置（Optima CT660 ProまたはLightSpeed Ultra 16、ともにGE社製）を用いて行った。CE-CTC群では、大腸の拡張は自動低圧炭酸ガス送出装置（HP-2®；堀井薬品工業社製）を用いて行った。 胃、肝臓（右葉、左葉）、膵尾部、門脈（PV）、脾静脈（SpV）、上腸間膜静脈（SMV）、下腸間膜静脈（IMV）のCT値を、それぞれ非造影CTと早期CTで測定した。造影CT値として、非造影CT画像とDCE-CT早期相画像のCT値（Hounsfeld unit値）の差を算出した。これらの測定は、2名の放射線科医がワークステーション（EV InsiteS；PSP社製）で各々行い、各臓器、血管の画像上に円形または楕円形の関心領域（ROI）を設定し、2人の測定した造影CT値の平均を算出した。また、肝偽病変の有無を共同で記録した。肝偽病変は、DCE-CT早期相で、肝左葉内側区の後縁または胆嚢窩の周囲にある高または低吸収領域として定義した。 Mann-Whitney U検定を用いて各臓器と血管ごとの造影CT値を比較した。また、カイ二乗検定を用いてCE-CTC群と対照群の間で肝病変の発症頻度を比較した。 結果： CE-CTC群と対照群の各臓器・血管における造影CT値の平均値の比較は表1のとおりで、CECTC群の肝実質(図1)、PV、SMV・IMV(図2)の造影CT値は、対照群に比べて有意に高かった。一方で、CE-CTC群の胃(図3）、膵尾部、SpVの造影CT値は、対照群に比べて有意に低かった。 肝偽病変は、CE-CTC群の6例（7％）において、肝左葉内側区の後縁（n＝5）または胆嚢窩周囲（n＝1）に低吸収領域として認められた（図4）が、対照群では認められなかった（p＝0.016）。表2は、CE-CTC患者で肝偽病変がある場合とない場合の肝臓の造影CT値を比較した結果で、肝偽病変のあるCE-CTC患者の肝の造影CT値は、肝偽病変のないCE-CTC患者の造影CT値よりも有意に高かった。

塩化ベンザルコニウム（BAC）は点眼防腐剤として広く用いられている。しかしながら、BACを含む点眼薬の長期使用は結膜下組織の線維化を誘発し、緑内障濾過手術後の濾過胞維持を困難にさせる。また、濾過胞を構成するテノン嚢線維芽細胞と角膜上皮細胞は涙液を介して互いに影響しているが、BAC曝露時のこの細胞間の反応については明らかにされていない。本研究で我々は、共培養システムを用いて、BACにより誘導されたヒトテノン線維芽細胞（HTF）の筋線維芽細胞転化に対するヒト角膜上皮（HCE）細胞の影響について、免疫蛍光染色ならびにウェスタンブロットで評価した。HTFのα-smooth muscle actin（αSMA）発現は、BAC添加により亢進し、HCE細胞との共培養により抑制された。HTFの培養上清中のIL-10濃度は、BACにより減少し、HCE細胞との共培養により増加した。また、BACによるHTFのαSMA発現亢進およびmyocardin-related transcription factor–A（MRTF-A）の核内移行は、IL-10添加によって抑制された。これらのことから、角膜上皮細胞は涙液中のIL-10濃度を維持し、HTFのMRTF-Aの核移行の抑制を介して、BACによる濾過胞線維化を軽減させる可能性が示唆された。

活性化転写因子1（ATF1）は、CREB/ATFファミリーの転写因子に属し、精巣で高発現している。しかし、精子形成におけるATF1の役割は未だ確立されていない。本研究では、精子形成におけるATF1の影響を解明することを目的として、マウスにおけるATF1の発現パターンとマウス精巣におけるATF1ノックダウンの影響を調べた。その結果、ATF1はさまざまな臓器で発現しており、精巣では非常に高いレベルで発現していることがわかった。免疫染色により、ATF1はspermatogoniaの核に局在し、増殖細胞核抗原(PCNA)と共局在することがわかった。ATF1欠損マウスでは、精巣の精細管にはすべての発生段階の細胞が存在していたが、spermatocyte以降の分化段階の細胞数は減少していた。同様にPCNAの発現が低下していた。一方で、精細管におけるアポトーシス細胞はほとんど見られなかった。これらの結果は、ATF1が男性生殖細胞の増殖と精子の生成に関与していることを示している。また、男性不妊症における乏精子症、無精子症の発症機序解明の可能性を示唆した。

前立腺癌細胞と骨芽細胞の相互作用は、前立腺癌骨転移の発生に不可欠である。近年、新規のアンドロゲン受容体標的薬（ARAT）が、転移性去勢未治療前立腺癌（mCNPC）や非転移性去勢抵抗性前立腺癌（nmCRPC）に対して承認されているが、これらの薬剤と骨微小環境や腫瘍との関係を調べることは極めて重要である。今回、我々は去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の骨微小環境を模倣した新規のin vitro 3次元微小環境モデルを確立し、アンドロゲン受容体標的薬の薬剤感受性と、アビラテロンとデュタステリドの併用療法の有効性を評価した。キトサンナノ繊維で表面をコートした細胞培養基材を用いて、GFPを導入したC4-2細胞（CRPC細胞株）とRFPを導入したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞を共培養し、去勢抵抗性前立腺癌の骨微小環境を模倣した。骨芽細胞とC4-2細胞の増殖はCell3 iMager duos（SCREEN）を用いて生細胞のまま解析し、骨芽細胞を維持したまま、最大30日間C4-2細胞の持続的な増殖を観察できた。また、骨芽細胞と共培養したC4-2細胞では、TGF-βの発現が増加し、上皮間葉転換（EMT）が促進されたことから、アンドロゲン受容体標的薬に対する抵抗性が示された。このモデルを用いて、各薬剤のIC50と、アビラテロンとデュタステリドの併用効果を評価した。アビラテロンとデュタステリドの併用療法は、それぞれの単剤投与と比較して、C4-2細胞の増殖を相乗的に抑制し、これは、ARアゴニストである3-keto-5α-abirateroneの減少によるものと考えられた。我々の新規骨微小環境モデルは、前立腺癌の薬剤感受性の評価に有用であり、今後このモデルは、前立腺癌の微小な骨転移から臨床的な骨転移に至るまでの未知のメカニズムの解析に役立つ可能性がある。